Máy PCR ( luân nhiệt) là gì ? Nguyên lí làm việc của máy PCR
1. Định nghĩa
- Máy phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là công cụ tiết kiệm chi phí và hiệu quả cao được sử dụng để khuếch đại các đoạn DNA hoặc RNA nhỏ được chọn từ bộ gen bằng cách sử dụng mồi.
- Còn được gọi là hệ thống PCR, chu trình nhiệt hoặc máy quay nhiệt, các thiết bị này kết hợp các nguyên tắc sao chép axit nucleic với lai axit nucleic bổ sung để tạo ra theo cấp số nhân các trình tự DNA / RNA mục tiêu cụ thể theo hệ số 10^7 trong vòng vài giờ.
- Kỹ thuật PCR, do Kary Mullis phát minh, hoạt động bằng cách liên kết các đoạn mồi với trình tự đích và mở rộng trình tự này bằng cách sử dụng Taq polymerase (thermus aquus). Các bước cơ bản của PCR thông thường được chia thành ba giai đoạn, tuy nhiên, tồn tại rất nhiều sửa đổi.
- Do tính phổ biến và sức mạnh của chúng, các hệ thống PCR được vô số nhà khoa học, nhà nghiên cứu và kỹ thuật viên săn đón, trong nhiều nghiên cứu, bao gồm cả xét nghiệm nhiễm vi-rút như vi-rút SARS-CoV-2 của đại dịch COVID-19.
- Hơn nữa, tùy chọn cho thuê những chiếc máy này làm cho chúng có thể tiếp cận được với cả các công ty khởi nghiệp công nghệ sinh học và các công ty doanh nghiệp.
2. Các yếu tố cần để thực hiện quy trình PCR
- DNA
- Buffer, chất môi trường
- Primer – chất mồi giúp các DNA polymerize biết nó phải bắt đầu sao chép từ đâu
- DNA Polymarize là loại chịu nhiệt vì quá trinhg PCR sử dụng nhiệt ( loại Taq Polymerase- loại này có nguồn gốc ở vi khuẩn chuyên sống ở nơi nóng như suối nước nóng)
- DNA Nucleotide thứ mà DNA polymerase sử dụng làm nhiên liệu để nhân bản
3. Nguyên lí hoạt động quá trình PCR
3.1. Denaturation-Biến tính- Dùng nhiệt để tách hai nhánh của DNA ra
- Trong giai đoạn biến tính (Denaturation), nhiệt độ cao tăng lên khoảng 94 - 98°C nhằm phá vỡ các liên kết hydro giữa các base trong chuỗi xoắn kép của DNA. Khi đó, hai mạch đơn của DNA sẽ được tách rời, tạo điều kiện cho các mồi (primers) có thể gắn vào vị trí mong muốn trên mỗi mạch trong giai đoạn tiếp theo (giai đoạn gắn mồi).
3.2. Annealing- Bắt cặp- Hai nhánh của DNA sẽ được làm nguội, sau đó Primer sẽ nối và sao chép các đoạn DNA mà mình muốn nhân lên
- Nhiệt độ của máy PCR sẽ được hạ xuống khoảng 50 - 65°C.
- Cơ chế gắn mồi: Mỗi mồi là một đoạn DNA ngắn, có trình tự bổ sung với một đoạn cụ thể trên mạch đích của DNA. Nhiệt độ annealing được tối ưu hóa sao cho mồi có thể gắn chính xác vào vị trí mong muốn trên mạch DNA, nhờ vào sự tương hợp giữa các base. Các mồi bám vào ADN tạo nên vùng ADN kép ngắn làm điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp ADN.
3.3. DNA Synthesis- Kéo dài đoạn DNA- Các DNA polymerase sẽ nhân bản bằng các dùng các DNA nucleotide để sao chép
- Máy luân nhiệt sẽ tăng nhiệt độ lên 72°C, đây là nhiệt độ tối ưu, hoạt động hiệu quả nhất của enzyme Taq polymerase.
- Taq polymerase sẽ gắn vào các mồi đã được liên kết với mạch DNA đích trong giai đoạn trước và bắt đầu tổng hợp một mạch DNA mới. Quá trình tổng hợp diễn ra từ đầu 5’ đến đầu 3’ của mồi, sử dụng các nucleotide tự do (dNTPs) có trong dung dịch phản ứng. Taq polymerase thêm các nucleotide theo trình tự bổ sung với mạch DNA khuôn mẫu, từ đó tạo ra mạch DNA mới.
- Thành quả là từ DNA xoắn kép sau đó tách thành 2 chuỗi DNA 
- Sau khi chu kỳ PCR sẽ kết thúc, và máy PCR sẽ bắt đầu chu kỳ tiếp theo bằng cách quay trở lại giai đoạn biến tính
- Chu trình nhiệt thường lặp lại 20 – 40 lần (tùy protocol) tạo ra nhiều bản sao trình tự ADN.
- Quá trình này lập lại theo cấp số nhân cơ số 2 2 mũ 2, 2 mũ 3,…
4. Máy PCR được dùng làm gì?
- Máy PCR, thường được gọi là hệ thống PCR, được sử dụng để tạo ra hàng triệu bản sao của một đoạn DNA nhỏ ban đầu.
- Quá trình này đôi khi còn được gọi là “photocopy phân tử”. Nó cho phép các nhà khoa học khuếch đại DNA đủ để nghiên cứu chi tiết, khiến nó trở thành một thiết bị cực kỳ có giá trị trong cả môi trường nghiên cứu và lâm sàng.
- Khuếch đại là cần thiết vì một đoạn DNA gần như không thể hoạt động trong quá trình phân tích phân tử và di truyền. Để khuếch đại DNA thành hàng triệu bản sao, cần phải khuếch đại PCR.
- DNA khuếch đại được tạo ra bởi PCR có nhiều công dụng khác nhau, bao gồm điều tra các bệnh di truyền, lấy dấu vân tay DNA và phát hiện vi khuẩn hoặc vi rút. Vì lý do này, PCR là một phần không thể thiếu trong nghiên cứu y sinh và pháp y tội phạm.
VỚI MỤC TIÊU LÀ ĐỂ XEM MẪU BỆNH PHẨM CÓ ĐỦ NỒNG ĐỘ VIRUS HAY KHÔNG
Như Virus Covid 19 ,nhưng khác ở điểm đó là thay vì PCR mà dùng Rrt-PCR (Reverse …)- đảo ngược vì
-
Virus này có vật chất di chuyền là RNA thay vì DNA nên phải reverse chuyển RNA sang DNA
-
Thêm bước dùng polymerase Reverse Transcriptase để biến RNA thành cDNA
Rồi lập lại các bước như PCR ở trên
Nếu không có virus thì Primer- chất mồi và các DNA polymerase không có việc làm và kết quả xét nghiệm là ÂM tính
5. Nguyên lí hoạt động REAL-TIME PCR
-
Bản nâng cấp cho PCR khi trong kỹ thuật PCR, sau khi khuếch đại đoạn DNA đích, người làm thí nghiệm phải tiếp tục làm một số bước để đọc kết quả và xác định có sản phẩm khuếch đại mong muốn hay không bằng kỹ thuật điện di (sử dụng máy điện di),
-
Hoặc sử dụng thí nghiệm lai với các mẫu dò đặc hiệu để xem sản phẩm khuếch đại có chứa sản phẩm mong muốn hay không.
-
Nhưng với REAL-TIME PCR người làm thí nghiệm không cần phải làm tiếp các thí nghiệm để đọc các sản phẩm khuếch đại. Các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thì nghiệm có thể thấy được
6. Một số sản phẩm của máy luân nhiệt thường được sử dụng
Hãy cùng AnHoaco xem qua một vài model máy luân nhiệt PCR
Hệ thống REALTIME PCR - AZURE CIELO 6 , Hãng: AZURE - USA LH: 0819.320.816
Máy luân nhiệt PCR 96 vị trí, Model:GTC96S$, Hãng: Cleaver Scientific/Anh( LH: 0819.320.816)
HỆ THỐNG REAL-TIME PCR, MODEL: T5000-96-E, Hãng: BENCHMARK/MỸ (LH: 0819.320.816)
Viết bình luận